Первый полёт на прототипе был выполнен Валерием Чкаловым (лётчик-испытатель Государственного авиационного завода № 39) — 30 декабря 1933 года. На Государственных испытаниях в феврале 1934 года двумя прототипами управляли лётчики Владимир Коккинаки и Василий Степанчонок. Лётчики давали отнюдь не лестные отзывы о самолёте, а после ознакомления с докладом лётчиков испытателей Юмашева и Чернавского — Алкснис, специальным приказом позволил управлять И-16 только самым опытным лётчикам. 1 и 2 марта пилотируемый Чкаловым И-16 проходил испытаний на штопор. После эксплуатационных испытаний в Крыму (Каче) самолёт был продемонстрирован широкой публике на первомайском параде. В 1935 году демонстрировался на Международной авиационной выставке в Милане.
1940 год — год самого массового выпуска — около 2710 машин.
Этот самолёт дал начало проекту И-17 (проект заморожен) и перспективному И-180 — на котором в первом же испытательном полете погибнет Чкалов, а затем и лётчики испытатели Степанченок и Сузи.
В 1952 году последние И-16 были сняты с вооружения ВВС Испании.
